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二、目的
了解限制性内切酶的特性和DNA分子的结构,掌握DNA限制性内切酶酶切的图谱的分析方法。
三、材料、试剂与器具
1、DNA样品。
2、限制性内切酶。
3、10×限制性内切酶反应缓冲液
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限制性核酸内切酶(restrictionendonuclease),又简称限制酶或内切酶。它们是基因工程和基因诊断重要的一类工具酶。它们的发现和应用为从基因组中分离目的基因提供了必要的手段.限制酶能特异地识别和切割特异的核苷酸序列,将双链DNA切成较小的片段。酶切后目的基因可能完整地或部分地保存于某一DNA片段上,并被分离出来。
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在基因插入的邻近末端部位选择一个单酶切点( B ),在载体上选一个单酶切点( A),用这两个内切酶分别酶切两份重组质粒,正、反两个方向的插入将产生不同大小的 DNA 片段,通过凝胶电泳即可鉴定插入片段方向是否正确.
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葡聚糖凝胶G系列使用说明
1 化学和物理性质
葡聚糖凝胶是一种珠状的凝胶,含有大量的羟基,很容易在水中和电解质溶液中溶胀。亲水基质使其非特异性吸附最小化,并在生物分子分离期间得到较高的回收率。G型的葡聚糖凝胶有各种不同的
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和反应环境中,1小时消化1μg
DNA所需的酶量为一个酶单位。由于种种原因,在实际使用时需适当增加增加酶量。现在一般用3~5单位的酶消化1μg
NDA;反应时间亦可延长到3小时以上乃至过夜;从而使得酶切反应更为完全。内切酶一般均保存
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自然界中。葡聚糖酶降解的多聚体在自然界中以纤维素和半纤维素的形式大量存在。在葡聚糖以外的其他酶中,糖原(a-1,4葡聚糖作为细胞多糖的一种基本储存模式)广泛存在于除了卵菌以外的含有β-1,3-葡聚糖的真菌中(Pitson et al.,1993
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核酸内切酶催化水解多核苷酸内部的磷酸二酯键。有些核酸内切酶仅水解5′磷酸二酯键,把磷酸基团留在3′位置上,称为5′-内切酶;而有些仅水解3′-磷酸二酯键,把磷酸基团留在5′位置上,称为3′-内切酶。还有一些核酸内切酶对磷酸酯键一侧的
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是选择不能在非酶切位点切断靶DNA的酶。裂解核心区的内切酶使反向PCR只能扩增引物所定模板(依赖于引物)的上游或下游区,而不裂解核心区的酶则使两侧序列都扩增。Southern杂交来确定内切酶用以产生大小适于环化及反向PCR的片段的末端片段。
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单一DNA样品一般是单条带,质粒的话可能会有2-3条带.如果条带变宽、变暗、或者变成弥散的DNA条带,表示DNA非特异的降解.如果条带变成多条,表示可能被酶切.如果质粒被单酶切,可能变成一条亮带.如果有蛋白质污染,上样孔可能发亮.如果有RNA污染,可能小分子量部分会有弥散.
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enzyme5' C^TCGAG 3'要查找更多内切酶的识别序列,你还可以选择下面几种方法:1. 查你所使用的内切酶的公司的目录或者网站;2. 用软件如:Primer Premier5.0或Bioedit等,这些软件均提供了内切酶识别序列的