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一种专一性的限制性内切酶切割所得扩增产物,凝胶电泳分离酶切片段,染色并进行RFLP分析。CAPS标记揭示的是特异PCR片段的限制性长度变异的信息。CAPS是一类共显性分子标记,其优点是避免了RFLP分析中膜转印这一步骤,又能保持RFLP分析的精确度。另外,由于很多限制性内切酶均可与扩增DNA酶切,所以检测到多态性机会较大。
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核酸内切酶催化水解多核苷酸内部的磷酸二酯键。有些核酸内切酶仅水解5′磷酸二酯键,把磷酸基团留在3′位置上,称为5′-内切酶;而有些仅水解3′-磷酸二酯键,把磷酸基团留在5′位置上,称为3′-内切酶。还有一些核酸内切酶对磷酸酯键一侧的
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并将其降解。 单位定义:在指明pH与37℃,在0.05mL反应混合物中,1小时消化1μg的λDNA的酶量为1单位。 性状制品不含非专一的核酸水解酶(由10单位内切酶与1μg λDNA,保温16小时所得的凝胶电泳图谱的稳定性表示),这类酶主要是从原核生物中分离出来的,迄今已经从近300多种不同的微生物中分离出约4000种限制酶。
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特异性的切点,因而DNA分子经过Ⅱ类酶作用后,可产生特异性的酶解片断,这些片断可用凝胶电泳法进行分离、鉴别。限制性内切酶识别DNA序列中的回文序列。有些酶的切割位点在回文的一侧(如EcoR I、BamH I、Hind等),因而可形成粘性末端
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一、 建立一个标准的酶切反应目前大多数研究者遵循一条规则,即10个单位的内切酶可以切割1μg不同来源和纯度的DNA。通常,一个50μl的反应体系中,1μl的酶在1X NEBuffer终浓度及相应温度条件下反应1小时即可降解1μg已纯化好的
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0.5-1.0ml/min为宜,因这类分子多无紫外吸收,一般采用示差折光检测器,选用对照品的分子量范围及颗粒形状应与供试品匹配,测定数据经适宜的GPC软件处理求得相关参数。3、含量测定一般来讲,多糖不含蛋白和氨基酸,蛋白或氨基酸检测应呈阴性
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一、实验目的1.通过对DNA的酶切,学会设计构建体外重组DNA分子;2.根据目的基因合理选择载体与限制性内切酶;3.掌握DNA的酶切技术。
二、实验原理
限制性内切酶是从细菌中分离出来的一种能在特异位点切割DNA分子的
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管(最好0.5ml)编号,用微量移液枪分别加入DNA
1μg和相应的限制性内切酶反应10×缓冲液2μl,再加入重蒸水使总体积为19μl,将管内溶液混匀后加入1μl酶液,用手指轻弹管壁使溶液混匀,也可用微量离心机甩一下,使溶液集中在管底
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Eppendorf管,做成其他5个片段的HindⅢ酶反应系统。2.将酶切反应系统轻轻混匀后,置于37℃水浴保温1~1.5h后终止反应。3.取适量样品用于琼脂糖凝胶电泳分析。同时用λDNA/EcoRⅠ标准品、λDNA/HindⅢ标准品、λDNA
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, 限制性内切酶用量可按标准体系1 μg DNA 加1 单位酶,消化1-2 小时。但要完全酶解则必须增加酶的用量,一般增加2-3 倍,甚至更多,反应时间也要适当延长。[实验仪器与设备]水平式电泳装置,电泳仪,台式高速离心机, 恒温水浴锅, 微量移液