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①选择合适的出发质粒出发质粒也叫亲本质粒,它应含有质粒克隆载体必备的元件,如复制起始位点、选择标记基因、克隆位点、启动子和终止子等。②正确获得构建质粒克隆载体的元件一般采用限制性核酸内切酶切割出质粒DNA分子,获得含有某种元件的DNA片段
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mRNA和CDS的序列是一致的,只不过是RNA和DNA的U和T的区别。PCR是合成DNA,当然是用CDS了。CDS是编码序列,染色体的DNA是体内转录后剪切才表达,构建质粒的DNA在体外细胞内培养剪切不了。酶切位点的选择是根据构建质粒所用
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、产物分类 (1)抗生素抗性:如氨苄西林、氯霉素抗性; (2)限制酶-修饰酶(R-M)系统:如hsdR-菌株可使DNA甲基化,但不限制外源DNA;hsd-菌株为限制和甲基化双缺陷型。 人工构建的质粒载体分类 高拷贝数的质粒载体
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Gateway克隆技术-BP反应构建入门载体与LR反应构建表达载体的区别
提到克隆、重组载体,就想到5字金言:分、切、连、转、筛,“分”是指分离制备合格的待操作的DNA;“切”是指用序列特异的限制性内切酶切开载体DNA
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大的质粒(大于15kb)不会很好转化而且DNA产量通常很低。在设计实验时要考虑到加入插入片段的最终载体大小,尽量用更小的载体。 兼容性 当多于一个质粒载体必须同时存在于同一个细菌细胞中,这两个质粒的复制子必须是兼容的。当他们不能
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,逆转录形成cDNA第一链,以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。 2、构建重组表达载体 (1)载体酶切:将表达质粒用限制性内切酶(同引物的酶切位点)进行双酶切,酶切产物行琼脂糖电泳后,用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。 (2
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。在构建表达载体前,应根据实验目的选取合适的表达质粒。比如进行实验时考虑是否需要reporter标签,是否需要药物筛选基因等。接下来以构建px330质粒为例,具体说明如何构建sgRNA表达载体。(图1)先确定20bp靶标序列(基因组序列应为
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①选择合适的出发质粒 出发质粒也叫亲本质粒,它应含有质粒克隆载体必备的元件,如复制起始位点、选择标记基因、克隆位点、启动子和终止子等。 ②正确获得构建质粒克隆载体的元件 一般采用限制性核酸内切酶切割出质粒DNA分子,获得含有某种
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质粒载体绝大多数是以天然质粒为基础,加以人工改造和组建。理想的细菌质粒载体,除去其他类型载体相同的特点外,还应具备以下条件: ①相对分子质量尽可能小,质粒越小,拷贝数越高,而且便于提取和纯化; ②DNA结构和功能清楚,质粒序列中
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pUC57载体载体基本信息载体名称pUC57载体抗性Ampicillin载体长度2710 bp载体类型Basic Cloning Vectors载体来源GenScript拷贝数High copy number5'引物M13 fwd3'引物M13 revpUC57载体质粒图谱